上海中医药大学肝病研究所(上海200032) 胡义扬

      肝纤维化是对肝脏损伤所表现出的"愈合反应"，其实质是肝脏胶原合成与分解的平衡被破坏，致使肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积，并且发生组分改变或重构。肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化，延缓、阻止甚至逆转肝纤维化，是慢性肝病治疗的重要对策。

      肝平胶囊（又名：扶正化瘀方、319方）由丹参、虫草菌丝、桃仁、松黄等组成，是上海中医药大学肝病研究所在临床实践基础上历经10余年研制的抗肝纤维化的中药复方。该方立足于肝纤维化的中医病机基础在于正气虚弱（肝肾阴虚,脾气虚弱)、湿毒内留、血瘀阻络的认识，以扶正化瘀立方。经系统的研究表明,该方抗肝纤维化作用显著，存在较广泛的药理作用途径。作为"八五"、"九五"期间国家和上海市的科技攻关成果，目前已即将完成国家中药Ⅲ类新药的Ⅲ期临床试验。本文就该药的有关药理研究作一概述。

 一、肝平胶囊抗肝纤维化作用
    通过临床慢性乙型肝炎肝纤维化治疗后部分肝组织活检的观察以及四氯化碳、二甲基亚硝胺（DMN）诱导的2种大鼠肝纤维化经典动物模型的多次重复试验研究表明，肝平胶囊不仅可以有效抑制肝纤维化的形成，并可促进肝纤维化的逆转。
    1、肝平胶囊能有效逆转慢性乙型肝炎肝纤维化
    八五期间，对肝平胶囊进行了治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步临床观察，经95例（其中32例用大黄蛰虫丸治疗为对照组）患者3个月疗程的观察，结果显示：慢性乙型肝炎患者血清MAO活性、金属蛋白酶组织抑制因子 -l（TIMP）、P-Ⅲ-P、Ⅳ-c、HA、LN含量等纤维化血清学指标均显著升高，经肝平胶囊治疗后这些异常变化均有不同程度下降，尿羟脯氨酸排泄量也显著增加，其中除TIMP指标外，改善程度均优于对照药物。其中治疗组12例患者进行治疗前后腹腔镜下2次肝活检，结果纤维化程度分级有7例治疗后显著减轻（较治疗前降低3期1例，2期4例，1期2例），无显著变化4例，仅1例继续加重；炎症活动指数治疗后有5例显著减轻，5例无明显改变，2例仍有加重。提示该方对慢性乙型肝炎，尤其是抗肝纤维化方面具有良好的治疗效果，可有效逆转肝纤维化。
    2、肝平胶囊能显著抑制四氯化碳毒素刺激过程中大鼠肝脏胶原的沉积。
    研究资料显示，运用四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型，在毒素刺激6周过程中同时分别用3种剂量肝平胶囊以及对照药物秋水仙碱和大黄蛰虫丸（预防性试验），其结果肝平胶囊可显著抑制肝组织纤维增生，在各药物组中以肝平胶囊高、中剂量为佳。作为胶原中的特殊氨基酸成分羟脯氨酸（Hydroxproline，Hyp），在模型组肝组织中含量达正常大鼠的2.1倍，肝平胶囊3种剂量组均较模型组有较大幅度的抑制（秋水仙碱也显示有良好的抑制效果，但大黄蛰虫丸作用不明显。）提示肝平胶囊能显著抑制毒素刺激过程中肝脏胶原的沉积。在其基础上，以有效剂量对该纤维化模型进行了2次以上的重复试验，研究结果均得以重复。进一步通过免疫组化技术证实肝平胶囊可显著减轻Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝组织中的表达。
    3、肝平胶囊能促进已成型的四氯化碳和DWN诱导的大鼠肝纤维化的逆转。
    实验以四氯化碳诱导大鼠肝纤维化后再予以治疗。结果见到，模型组肝纤维化程度在停止毒素刺激后有所减轻，肝脏Hyp含量为正常组1.85倍。然而，药物作用后，其纤维化程度的恢复较模型组更为明显，其中肝平胶囊和秋水仙碱组作用强度相近，纤维化积分显著低于模型组，Hyp含量仅为模型组含量的63%。大黄蛰虫丸有效但作用强度明显弱于前者。另从DMN 诱导大鼠肝纤维化模型后的治疗实验证实:模型组2/3大鼠肝脏可见由胶原纤维构成的中心一门脉间隔出现，但未见完整的假小叶形成，肝平胶囊组和秋水仙碱组纤维化程度均较模型组显著减轻；模型组Hyp含量达正常组3倍，而肝平胶囊组和秋水仙碱组含量均值仅为模型组的47%和45%，较模型组大幅度地下降。上述2项治疗性试验均证实，肝平胶囊可促进肝纤维化的逆转。

二、肝平胶囊抗肝纤维化的作用机理
    1、拮抗肝星状细胞的活化
    肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纤维化发生发展的核心环节。肝脏中多种细胞可产生、分泌细胞外基质，包括HSC、肝细胞、肝血窦内皮细胞等，但在肝纤维化发生过程中，细胞外基质的主要来源是激活的HSC激活后转化的肌成纤维细胞（MFB）。HSC的活化是肝纤维化的细胞学基础，增殖及纤维增生能力增强是其活化的两个重要特点。抑制HSC活化己成为抗肝纤维化的中心策略。
    经肝平胶囊药物血清分别作用于正常大鼠中分离传代培养的正常肝星状细胞和以血小板生长因子（PDGF-bb）剌激活化肝星状细胞的试验表明：（l）与正常传代HSC相比，PDGF-bb明显剌激细胞增殖（两者均值比约1:2）；（2）肝平胶囊药物血清对上述细胞增殖均有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性，秋水仙碱有类似效应，作用强度两药物相当。（3）肝平胶囊药物血清可抑制传代活化HSC内、外的胶原生成率，抑制程度细胞内大于细胞外，呈药物浓度依赖性；而对照药物秋水仙碱则主要表现为对细胞外胶原的抑制，在细胞内反而增加。（4）肝平胶囊药物血清对传代细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达均有明显的抑制作用，抑制率分别达45.7%、22%、33%，以对Ⅰ型胶原的抑制突出。（5）对传代细胞Ⅰ型胶原蛋白的分泌量有明显抑制作用，并显著降低I型前胶原mRNA的表达；（6）显著降低HSC的TGFβ1mRNA表达，同时免疫细胞化学检测也显示对其蛋白表达有显著抑制作用。
    实验还采用了二甲基亚硝胺（DMN）诱导的大鼠肝纤维化模型，以肝平胶囊治疗1周，末次给药2h后分离"纤维肝HSC"，复以药物血清作用，以了解药物对整体动物模型作用后肝星状细胞的功能变化。结果显示：肝平胶囊体内用药同样可明显抑制纤维肝原代HSC细胞增殖及其细胞内与细胞外胶原生成率。
    HSC活化后转化为肌成纤维细胞。以肝平胶囊药物血清作用于NIH/3T3成纤维细胞，结果表明：其细胞的增殖，细胞内和细胞外胶原生成率，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白的表达均受到了显著抑制。
    由此可见，肝平胶囊可抑制不同病理生理状态HSC的增殖，抑制其TGFβ1和I型胶原基因表达与分泌，即对HSC活化有显著的拮抗作用。

    2、抑制旁分泌和自分泌对HSC活化的影响
    目前认为HSC的激活至少经过如下两个步骤：首先在损伤肝细胞和kupffer细胞（KC）的作用下，HSC的胞体扩大，表达α-平滑肌肌动蛋白，诱导产生各种细胞因子受体。然后在增殖和纤维产生因子的作用下（如TGFβ1.、PDGF、bFGF、HGF等），通过细胞信号传导途径，HSC的活化持续存在，并能够通过释放自分泌因子激活静止的HSC，维持自我活化，导致大量的细胞外基质的产生。即影响HSC活化有旁分泌和自分泌两大途径，其中前者是HSC活化的启动因素。对于其激活HSC的复杂的机制，现已发现肝平胶囊在以下几方面存在药理作用。
    l)干预损伤性KC对HSC的旁分泌激活
    实验通过分离正常大鼠和四氯化碳损伤48h大鼠的肝KC，以肝平胶囊药物血清作用后，取其培养的细胞上清作为"条件培养液"再作用于原代培养的HSC方法研究发现：（1）与正常KC比较，四氯化碳损伤KC分泌的活化型与总体TGFβ1活性及PDGF活性明显增强，而药物血清组显著抑制了上述指标的活性增强。（2）正常肝KC条件培养液的不同浓度在各时相均对HSC的增殖无明显影响，而损伤肝KC条件培养液在48h和72h时相对HSC的增殖有明显的促进作用，与浓度和温育时间呈正相关，药物血清作用后肝KC条件培养液则对HSC的增殖显著抑制，接近正常组水平。同时，损伤肝KC条件培养液显著增加HSC的I型胶原分泌（达正常组2倍），而药物血清组则为近于正常组水平。以上结果表明,损伤肝KC分泌TGFβ1和PDGF，是剌激HSC活化的重要旁分泌途径，肝平胶囊可通过影响损伤肝KC功能，抑制其旁分泌，以减轻对HSC的刺激、活化。
    2）干预活化的HSC对静止HSC的自分泌活化
    实验采用HSC体外活化模型，即分离大鼠肝HSC，在无包被的塑料培养皿中培养并传代，使之体外自活化。再经肝平胶囊药物血清作用后，将其上清作为条件培养液作用于原代HSC。结果显示，在72时，自活化HSC上清对HSC增殖有明显的促进作用，有浓度依赖性，而药物血清组对其病理性促HSC增殖有抑制作用。同时,未活化HSC组I型胶原分泌量为22.3±5.2ng/ml,活化HSC上清作用组为67.7±27.39ng/ml时，药物血清作用组仅为19.6±8.2ng/ml。结果表明：本身活化的HSC是重要的自分泌激活静止HSC的途径，肝平胶囊药物血清可通过影响活化HSC的功能而抑制其自分泌活化，干扰这一活化的"级联反应"。
    3）抗肝细胞脂质过氧化损伤以减轻过氧化产物对HSC的刺激
    目前己有不少资料表明，损伤肝细胞所产生脂质过氧化产物如丙二醛（MDA）可以直接刺激HSC活化。在CCl4肝脏毒性作用诱导的实验性肝纤维化中，肝脏脂质过氧化损伤是其重要机理。在DMN诱导的大鼠肝纤维化中，也存在脂质过氧化的损伤机制。实验证实肝平胶囊可显著提高在上述2个模型中表现为显著低下的肝组织SOD活性，降低模型组中大幅度提高的MDA含量，对照药物秋水仙碱组则无此效应。表明肝平胶囊有显著的抗脂质过氧化损伤作用，这一作用结果可使过氧化产物减少从而减轻对HSC的刺激活化。

    3、影响胶原代谢的酶活性以促进胶原的降解
    肝脏胶原纤维的病理性蓄积，反映了胶原合成或分解代谢的改变。其胶原合成与分解代谢过程中，基质金属蛋白酶可降解正常的肝脏基质成分和新沉积的间质胶原，在纤维化过程中起着重要的作用。迄今，至少已发现18种基质金属蛋白酶，根据其降解底物和功能的不同，主要可归为间质胶原酶、明胶酶、基质分解素、膜型基质分解素等4类。其中前者可降解间质胶原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原），而明胶酶类又称Ⅳ型胶原酶，主要降解基底膜（Ⅳ型）胶原和变性的间质胶原。在四氯化碳诱导的肝纤维化试验中可以观察到，肝纤维化炎症活动期与相对稳定期肝内胶原酶活性变化是不同的，在毒素剌激（炎症）过程中（预防性实验），肝内间质胶原酶活性显著升高，肝平胶囊表现为显著抑制，可能主要与抑制炎性反应有关；停止毒素剌激后（治疗性实验），处相对稳定期肝纤维化过程中，其间质胶原酶活性表现为显著低下，而肝平胶囊和秋水仙碱组治疗后则皆显著提高其肝组织间质胶原酶活性。另从DMN诱导的模型治疗实验观察到，模型组肝组织明胶酶（MMP-2）比活性显著低于正常组，同时基质金属蛋白酶抑制物-2(TIMP-2)含量(11.3±2.39)显著高于正常组；而肝平胶囊治疗组MMP-2活性显著提高至正常水平，同时TIMP-2含量也接近正常组水平。提示肝平胶囊可提高肝纤维化时处于低下的间质胶原酶活性和MMP2活性，降低升高的TIMP-2。即可影响胶原代谢的有关酶活性，以促进胶原的降解。

    4、抗肝窦毛细血管化
    肝窦毛细血管化是肝纤维化过程中一个重要的病理改变，肝窦内皮细胞失窗孔及内皮
下基底膜的形成是肝窦毛细血管化的两个重要标志。以DMN诱导的肝纤维化模型（4周12剂法）,用肝平胶囊治疗4周，并着重从形态学观察肝窦壁第VIII因子相关抗原（vWF）、层粘连蛋白（LM）、IV型胶原（Col IV）、α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）变化以及肝脏超微结构的变化，探讨对肝窦毛细血管化的影响实验发现:（1）模型组出现腹水率为36.36%，肝平胶囊组为21.43%。(2)肝平胶囊显著降低模型组中升高的肝组织Hpy含量，血清透明质酸(HA)，显著减轻肝脏纤维增生程度。（3）模型组肝窦壁vWF、LM、Col IV、α-SMA免疫组化染色皆不同程度地强阳性表达，而肝平胶囊治疗组上述指标的阳性表达均显著轻于模型组。（4）电镜下模型组大鼠肝窦扭曲、狭窄，内皮细胞胞浆窗孔减少或消失,有程度不等的基底膜出现，而肝平胶囊组肝窦扭曲、狭窄程度较轻，其内皮窗孔减少或消失程度也较模型组轻，其基底膜出现程度也较薄或不连续，有的肝窦结构接近正常。上述研究结果表明，肝平胶囊可促进肝窦毛细血管化的逆转。因此对改善肝细胞与肝窦之间的物质交换，改善血液循环和肝细胞周围细胞外基质的微环境，削弱一些有害物质对肝细胞的连续损伤，组织肝纤维化的发展并促进其逆转有重要意义。

    5、抗肝损伤、保护肝细胞
    肝脏炎症反应是肝纤维化的重要启动因素。对于导致肝纤维化的最常见的慢性肝病--
病毒性肝炎，其病因治疗在临床上缺乏理想措施的情况下，保护肝细胞，预防和治疗肝细胞损伤是阻断肝纤维化发生和发展的基础。不少证据表明，肝平胶囊有显著的抗肝损伤，保护肝细胞的作用。如：1）在四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤肝纤维化模型预防性试验中，模型大鼠血清ALT、AST活性和肝组织GGT活性显著升高，血清白蛋白含量显著下降，肝细胞病理损伤严重，脂肪变性明显。肝平胶囊组中、高剂量组可显著抑制上述酶活性的升高，3个剂量组均抑制白蛋白含量的下降，同时肝细胞病理状态明显改善。（对照药物秋水仙碱也有抑制白蛋白下降作用，但对ALT、AST活性升高的抑制无明显效应。大黄蛰虫丸则对AST的升高无明显影响）：该模型动物在终止病因刺激5周后，血清白蛋白含量及ALT活性虽有所恢复，但仍与正常组有显著差异，而肝平胶囊组仍表现为可提高Alb含量，降低ALT活性，与模型组有显著差异（2个对照药物组则对上述变化无明显影响），显示肝平胶囊可促进肝细胞损伤的修复。2）DMN模型治疗实验显示，肝平胶囊可显著降低模型组中升高的ALT、AST活性，和胆红素含量，显著提高肝组织白蛋白mRNA的表达。3）通过体外肝细胞分离并经四氯化碳熏蒸所致肝细胞急性损伤的实验表明，四氯化碳体外急性损伤60min后，肝细胞发生退缩，胞膜欠清晰，胞浆粗糙，脂滴较多，细胞损伤严重。其24h和48hd培养液中ALT、AST皆显著升高（ALT活性达正常组4-5倍，AST达正常组2.5倍；而肝平胶囊药物血清组在48h时，细胞上清ALT、AST活性显著低于模型组，白蛋白含量显著高于模型组。此外，其肝细胞出现系列损伤指标变化的同时，细胞内、外胶原生成率皆有显著升高，而肝平胶囊药物血清组的细胞内外的胶原生成率明显低于模型组（秋水仙碱组表现为可大幅度抑制细胞外的胶原生成率而细胞内胶原增加，可能与其作用于微管系统，影响胶原分泌于细胞外有关）。同样，对体内四氯化碳以及DMN慢性损伤所分离的"纤维肝"肝细胞实验观察，皆表现较为一致的实验结果。4）临床治疗慢性乙型肝炎及肝炎后肝硬化患者结果表明，可显著改善患者血清肝功能指标。
    6、其他
    l)对免疫功能的影响：经小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验、血清溶血素测定及白细胞移动抑制试验结果表明：肝平胶囊能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞功能及经抗原(SRBC)刺激后的抗体（溶血紊）的生成量，抑制小鼠白细胞移动，即对小鼠细胞免疫及体液免疫有较明显的促进作用。临床肝炎后肝硬化患者治疗前后表明，肝平胶囊组细胞免疫功能明显改善，表现为CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+ 、NK细胞活性显著上升；体液免疫亢进得到控制，IgG、lgA、IgM含量降低，补体C3水平上升。
    2）对氨基酸和激素代谢的影响：肝平胶囊可显著提高在四氯化碳肝纤维化模型大鼠中明显下降的支链氨基酸/芳香族氨基酸（BCAA/AAA）比值。临床观察显示，7例肝炎后肝硬化患者治疗后，BCAA/AAA比值6例上升，1例微降，而对照组7例仅1例上升，1例持平，5例继续下降，两组间治疗前后差值比较有显著差异。肝平胶囊还可使肝炎后肝硬化患者异常升高的E2/T比值和rT3显著下降，处于低下的T3/rT3比值显著回升。

    三、小结
    目前认为，肝纤维化防治策略可概括为6方面，即去除病因（根本策略）、保护肝细胞（基本策略）、减轻肝脏炎症、拮抗HSC活化（中心策略）、促胶原降解、促HSC凋亡。与肝纤维化发生发展的复杂机理相对应，肝平胶囊作为一由复杂成分组成的中药复方，通过对多种肝损伤肝纤维化体内模型的反复药理试验、体外和体内外结合的肝脏主要相关细胞（肝星状细胞、肝细胞、成纤维细胞、kupffer细胞）功能影响的试验、临床慢性乙型肝炎肝纤维化和肝硬化的初步治疗观察，结合细胞外基质、影响胶原代谢的部分细胞因子、胶原酶、肝功能等等关键指标的细胞分子水平的技术检测手段运用，充分表明肝平胶囊有显著的抗肝纤维化、逆转肝纤维化的作用。其作用机理途径主要有：拮抗肝星状细胞的活化、抑制旁分泌和自分泌对HSC活化的影响、影响胶原代谢的酶活性以促进胶原的降解、抗肝窦毛细血管化、抗肝损伤、保护肝细胞等。新近的肝平胶囊拆方配伍研究揭示，该方不同的药性配伍和治法配伍有着其不同的作用靶点。
    总之，肝平胶囊抗肝纤维化作用显示出多方位、多靶点的药理特点，这也正是中药复方抗肝纤维化的特色和优势所在。

【主要参考文献】略